О специфичности вируса хронического паралича пчел. П.Л. Талпалацкий, В.С. Гребенников. В кн. Болезни пчел на Дальнем Востоке, Новосибирск, СО ВАСХНИЛ, 1980, с.18-21

О специфичности вируса хронического паралича пчел

П. Л. Талпалацкий,
ДальЗНИВИ
В. С. Гребенников,
Сибирский НИИ химизации сельского хозяйства СО ВАСХНИЛ

УДК: 576. 858:638.158

Мы располагаем незначительными сведениями о специфичности вирусов медоносных пчел. Бейли считает, что вирус острого паралича пчел, по-видимому, является единственным патогеном медоносных пчел, имеющим альтернативного хозяина в природе (1, 2). Для выяснения специфичности вируса обычно пользуются понятием круга заражаемых хозяев, то есть способностью вируса поражать разные виды и даже роды и отряды насекомых (3).

В летние месяцы 1974—1976 гг. нами предпринимались попытки искусственно заразить насекомых отряда Hymenoptera подотряда Аросrita вирусом хронического паралича (4), выделенным в Приморском крае. В 1977 г. этим же вирусом были, заражены колонии двух видов общественных насекомых из семейств Apidae и Vespidae.

В условиях лаборатории заражали следующих насекомых: семейство Apidae, род Xylocopa, вид X. Violacea — 3 особи; род Bombus, вид В. lucorum — 11 особей; семейство Vespidae, подсемейство Vespenae, род Vespa L., вид V. crabro — 31 особь; род Dolichovespula Rohwer, вид D. media Retz — 18 особей; род Vespula Thorns, вид V. vulgaris — 15 особей. Кроме того, по три особи из перечисленных видов насекомых, отловленных в пределах территории пасек, пораженных вирусом хронического паралича пчел исследовались на присутствие у них данного вируса.

Отловленных насекомых заражали путем скармливания им вирусной суспензии (инфекционный титр 108 инфекционных единиц) в смеси с сахарным сиропом (две части сахара на одну часть воды) в соотношении 1:2, и также инъекцией в гемоцель. Доза инокулята — 0,001 мл. Зараженных особей помещали в термостат при 35°. Нативным материалом каждой инъекции, через 7 суток после начала опыта, заражали медоносных пчел.

Однотипность выделенных вирусов определяли в реакции нейтрализации с иммунными сыворотками, полученными иммунизацией кроликов.

Антисыворотку готовили путем инъекции кроликам суспензии, полученной из пчел, пораженных вирусом. Предварительно суспензию освобождали от присутствия антител, специфичных к нормальным тканям самой пчелы (5). Животным вводили суспензию здоровых пчел и, таким образом, получали антисыворотку к нормальным тканям пчелы. Эту антисыворотку использовали для осаждения всех нормальных антигенов пчелы из суспензии, содержащей вирус. Суспензию, которая не содержала каких-либо иных антигенноактивных веществ, за исключением вируса, использовали для получения антисыворотки, специфичной к вирусу. Специфические сыворотки получали 5-кратной внутривенной иммунизацией кроликов по схеме:

Через две недели после последней инъекции у кроликов брали кровь. Титр каждого антигена и индекс нейтрализации определяли по Риду и Менчу (6). Для установления антигенного родства выделенных вирусов использовали метод диффузионной преципитации в агаре (7, 8). В отдельных случаях для усиления полос преципитации пользовались раствором CdS04 (9, 10).

Кишечник пчел, зараженных нативным материалом из энтомофауны, исследовали гистологически и иммуногистохимически (11). Для устранения неспецифического свечения срезов основной раствор сыворотки перед использованием обрабатывали порошком, приготовленным из свободных от вируса пчел (12). Мозг и кишечник зараженных насекомых обрабатывали и просматривали в электронном микроскопе УЭМВ-100К.

В условиях энтомологического микрозаповедника Института химизации сельского хозяйства и Института кормов СО ВАСХНИЛ в сезоне 1977 г. были подготовлены приманочные ульи (13—17) для шмелей разных видов. После специального учета для заражения была выбрана сформировавшаяся семья В. hortorum. Обнаруженная на территории заповедника колония V. crabro также подверглась заражению. Для наблюдения за поведением насекомых после заражения и вирусологического обследования обе колонии были переведены в энтомологический музей Института химизации СО ВАСХНИЛ.

Колонии V. crabro и В. hortorum в течение суток выдержали без корма. Заражение V. crabro проводили двумя способами: а) путем скармливания живых медоносных пчел, экспериментально инфицированных вирусом хронического паралича; б) дачей вируса в смеси с медом (1:2). В. hortorum после голодания в специальной кормушке скармливали мед в смеси с вирусом (2:1).

Заражение проводилось в течение одного светового дня. Насекомых, использовавших зараженный корм, метили специальным красителем.

Вирусологическое обследование насекомых, отловленных в пределах пасек, пораженных вирусом хронического паралича, ни в одном случае не показало присутствия в их органах и тканях этого вируса. Экспериментальное заражение одиночных особей этих же видов насекомых, как правило, заканчивалось гибелью. Однако вирус паралича пчел при этом не выделялся. При непрямой иммунофлуоресценции гистосрезов кишечника зараженных насекомых специфическое свечение не было достаточно четким уже через 3 часа после заражения. Гибель насекомых можно объяснить действием необычных для них условий содержания, обусловленных опытом.

Наблюдения после дачи зараженного корма за семьей В. hortorum не показали каких-либо отклонений в их поведении. Насекомые охотно собирали пыльцу из свежих букетов цветов, которые регулярно им подставляли, и мед из кормушки. Вирусологический анализ материала, подготовленного из шмелей этой семьи, не выявил вируса паралича медоносных пчел.

Колония V. crabro 4 суток после заражения вела себя обычно, несмотря на гибель двух особей на 4-е сутки. На 6-е сутки вся колония пришла в необычное возбуждение. В эти и последующие трое суток отмечалось выбрасывание расплода, усилился резкий неприятный запах из гнезда, который быстро восстанавливался после производимой нами чистки микроинсектария. На 9—10-е сутки возбуждение шершней сменилось угнетением. Осы неохотно поедали корм, принимали самые необычные, не свойственные им позы. Отмечались судорожные подергивания тела, крыльев, конечностей. Вынос личинок из гнезда увеличился. Большая часть личинок сбрасывалась в подставленную шершням для питья открытую чашку Петри с водой. На 11-е сутки началась массовая гибель насекомых. Клиническая картина при этом очень напоминала вирусный паралич у медоносных пчел. С 12 по 14-е сутки количество погибших насекомых сокращалось. На 15-е сутки погибших взрослых насекомых и расплода не обнаружено. Прекратилось и начавшееся с момента гибели ос постоянное расширение гнезда за счет обгрызания нижней части свода.

При электронной микроскопии кишечника шершней не было обнаружено каких-либо вирусных образований.

Электронная микроскопия головного мозга V. crabro выявила вирусные образования размером 60—70 нм, а также обширные зоны и мелкие скопления меланина (см. накидку, рис. 1—2). Вирусные образования морфологически отличались от вируса хронического паралича пчел. Реакция диффузионной преципитации в агаре не выявила антигенного родства между этими вирусами.

Заражение свободных от вируса паралича пчел материалом, приготовленным из V. crabro в период их массовой гибели, вызвало массовую гибель пчел в условиях садковых опытов. Однако во втором и третьем пассажах гибели пчел не происходило.

Следует отметить, что гибель пчел обнаружилась только при инокуляции вирусного материала в гемоцель и не отмечена при заражении их методом скармливания.

Безусловно, круг заражаемых хозяев позволяет составить определенные представления о специфичности вируса. Однако при этом мы сталкиваемся со многими факторами, затрудняющими окончательное решение вопроса. К числу их относится прежде всего возможность активизации собственной латентной инфекции при заражении чужеродным вирусом (3), что и произошло в данном случае. Необходимы дальнейшие исследования — в частности большего числа видов одиночных пчел — для определения круга заражаемых хозяев вирусов Apis mellifera L.

Литература

1. Вailey L., Gibbs A. S., Woods P. D. Sacbrood viruses of the larvae honey bee. (Apis, mellifera Linaeus). Virology, 23, 425—429.

2. Bailey C. Recent research on honey bee viruses. Bee World. 1975, 56, 2, 55—64.

3. Тарасович Л. M. Вирусы насекомых. М., Наука, 1975, 89.

4. Талпалацкий П. Л. К этиологии летней гибели пчел в Приморском крае. — В сб.: Вирусологические исследования на Дальнем Востоке. ДВФ СО АН СССР. Владивосток, 1969; 105—107.

5. Дунин М. С., Попова Н. Н. Капельный метод диагностики вирусов в растениеводстве. Сельхозгиз, 1937.

6. Шубладзе О. К., Гайдамович С. Я. Краткий курс практической вирусологии. Медицина, 1954.

7. Ouchterloni О. Diffusion-in gel. methods for immunological analysis. Progr. in Aller, 1958, 51.

8. Зильбер Л. А., Абелев Г. И. Вирусология и иммунология рака. Гос. изд. мед. лит., 1962.

9. Crowle A. J. Enhancement by cadmium of double diffusion precipitation reactions. J. Immunol. 1968, 1, 194.

10. Crowle A. J. Enhancement by various cations of the double diffusion precipitation on tegt. Int. Acch. Allergy, 1960, 26, 113.

11. Талпалацкий П. Л., Полтев В. И., Гулий В. В. Цитоморфология эпителия кишечника при экспериментальном вирусном параличе пчел. Изв. СО АН СССР, 1971, 3, 133—137.

12. Николау М. С., Кажал Н., Николау К. Элементы общей инфрамикробиологии. Бухарест, 1965.

13. Гребенников В. С. Подземные приманочные ульи для шмелей. Пчеловодство, 1972, № 3.

14. Гребенников В. С. Опыт доместикации шмелей в окрестностях Исилькуля Омской области. Зоологические проблемы Сибири. Новосибирск, 1972, 67—68.

15. Гребенников В. С. К вопросам охраны шмелей — ценных опылителей. — В сб.: Охрана и реконструкция природных ресурсов в Центрально-Черноземной полосе. Воронеж, Воронежский гос. ун-т, 1972, 76—82.

16. Гребенников В. С. Шмели — наши помощники, их надо беречь. Корма, 1972, 27—28.

17. Гребенников В. С. Опыт организации энтомологических заповедников и документальное их оформление. — В сб.: Об охране насекомых. Материалы совещания. Межд. Горного комитета, секция охраны насекомых. Ереван, 1975, 31—41.