Предыдущая версия.
Зеркало.

Заражение колоний насекомых отряда Hymenoptera вирусом паралича пчел. П.Л. Талпалацкий, В.С. Гребенников. В кн. Биологические методы борьбы с вредными организмами, Новосибирск, СО ВАСХНИЛ, 1980, с.31-38

УДК 632.937

И. Л. Талпалацкий, В. С. Гребенников

Заражение колоний насекомых отряда hymenoptera вирусом паралича пчел

Мы располагаем незначительными сведениями о специфичности вирусов медоносных пчел. Бейли [1, 2] считает, что вирус острого паралича пчел является единственным патогеном медоносных пчел, имеющим альтернативного хозяина в природе. Для выяснения специфичности вируса обычно используют понятие круг заражаемых хозяев, то есть способность вируса поражать разные виды в пределах рода, семейства и более крупных таксономических единиц беспозвоночных животных [3].

В летние месяцы 1974-1976 гг. нами предпринимались попытки искусственного заражения насекомых отряда Hymenoptera подотряда Apocrita вирусом паралича [4], выделенным в Приморским крае. В 1977 г. этим же вирусом были заражены колонии двух видов общественных насекомых из семейств Vespidae и Apidae.

В лаборатории заражали следующих насекомых: Xylocopa violacea (сем. Anthophoridae) - 3 особи, Bombus lucorum (сем. Apidae) - 11, Vespa crabro (сем. Vespidae) - 31, Dolichovespula media (сем. Vespidae) - 18, Vespula vulgaris (сем. Vespidae) - 15 особей.

Кроме того, на присутствие вируса исследовали по 3 особи перечисленных видов насекомых, отловленные в пределах территории пасеки, пораженные вирусом паралича пчел.


Рис. 1. Подземный улей с семьей В. hortorum, перенесенный в вольеру, устроенную в окне.

Рис. 2. Отрезок трубы внутренним диаметром 10 см, заселенный семьей V. crabro и перенесенный в лабораторию. На переднем плане выгул, в крыше которого расположено устройство для подкормки и мечения насекомых.


Отловленных насекомых заражали путем скармливания им вирусной суспензии (титр 108 инфекционных единиц) в смеси с сахарным сиропом (2 части сахара на 1 часть воды), а также инъекцией в гемоцель. Доза инокулята 0,001 мл.

Зараженных особей помещали в термостат при 35°С. Нативным материалом каждой инъекции через 7 суток после начала опыта заражали медоносных пчел.

Однотипность выделенных вирусов определяли в реакции нейтрализации с иммунными сыворотками, полученными иммунизацией кроликов.

Антисыворотку готовили методом инъекции кроликам суспензии, полученной из пчел, пораженных вирусом. Предварительно суспензию освобождали от присутствия антител, специфичных к нормальным тканям пчелы [5]. Животным вводили суспензию здоровых пчел, и таким образом получали антисыворотку к нормальным тканям пчелы. Ее использовали для осаждения всех нормальных антигенов пчелы из суспензии, содержащей вирус. Суспензию, которая не содержала каких-либо иных антигеноактивных веществ, за исключением вируса, использовали для получения антисыворотки, специфичной к вирусу. Специфические сыворотки получали 5-кратной внутривенной иммунизацией кроликов (таблица).


Схема иммунизации кроликов (титр суспензии 108 инфекционных единиц в 1 мм)


№ инъекции Кол-во вводимого материала, мл Интервал между инъекциями, дней
1 2 -
2 3 3
3 5 3
4 5 6
5 5 7

Через 2 недели после последней инъекции у кроликов брали кровь. Титр каждого антигена и индекс нейтрализации определяли по Риду и Менчу [6].

Для установления антигенного родства выделенных вирусов использовали метод диффузионной преципитации в агаре [7, 8]. В отдельных случаях для усиления полос преципитации пользовались раствором CaSO4 [9, 10] .

Кишечник пчел, зараженных нативным материалом из энтомофауны, исследовали гистологически и иммунногистохимически [11]. Для устранения неспецифического свечения срезов основной раствор сыворотки перед применением обрабатывали порошком, приготовленным из свободных от вируса пчел [12].

Мозг и кишечник зараженных насекомых обрабатывали и просматривали под электронным микроскопом УЭМВ-100К.

В энтомологическом микрозаповеднике СибНИИХима и СибНИИ кормов СО ВАСХНИЛ в 1977 г. были подготовлены приманочные ульи [13-17] для шмелей разных видов. После специального учета для заражения была выбрана сформировавшаяся семья B. hortorum; обнаруженная на территории заповедника колония шершней V. crabro также подвергалась заражению. Для наблюдения за поведением насекомых после заражения и вирусологического обследования обе колонии были переведены в лабораторное помещение Сибирского научно-исследовательского института химизации сельского хозяйства СО ВАСХНИЛ (рис. 1, 2).

Колонии V. crabro и B. hortorum в течение суток выдержали без корма. Заражение V. crabro провели двумя способами: а) путем скармливания им живых медоносных пчел, экспериментально инфицированных вирусом паралича; б) дачей вируса в смеси с медом (1:2).

B. hortorum после голодания скармливали мед в смеси с вирусом (2:1) в специальной кормушке (рис. 3). Заражение проводили в течение одного светового дня. Насекомых, которые поедали зараженный корм, метили специальным красителем.

Вирусологическое обследование насекомых, отловленных в пределах пасек, пораженных вирусом паралича, ни в одном случае не показало присутствие в их органах и тканях этого вируса.

Экспериментальное заражение одиночных особей этих же видов насекомых, как правило, заканчивалось их гибелью. Однако вирус паралича пчел при этом выделить не удалось. При непрямой иммунофлюоресценции гистосрезов кишечника зараженных насекомых специфическое свечение не было достаточно четким уже через 3 часа после заражения. Гибель насекомых можно объяснить действием необычных для них условий содержания.

Наблюдения за семьей B. hortorum после скармливания зараженного корма не показали каких-либо отклонений в ее поведении. Насекомые охотно собирали пыльцу из свежих букетов цветов, которые регулярно им подставляли, и поедали мед из кормушки. Вирусологический анализ материала, приготовленного из шмелей этой семьи, не выявил вируса паралича медоносных пчел.

Поведение колонии V. crabro четверо суток после заражения также было нормальным, несмотря на гибель 2 особей на 4-е сутки. На 6-е сутки вся колония пришла в необычное возбуждение. В эти и последующие трое суток отмечалось выбрасывание расплода, усиление резкого неприятного запаха из гнезда, который быстро исчезал после чистки микроинсектария. На 9-е и 10-е сутки возбуждение шершней сменилось угнетением. Осы неохотно поедали корм, принимали самые необычные, несвойственные им позы. Отмечались судорожные подергивания тела, крыльев, конечностей (рис. 4). Вынос личинок из гнезда увеличился. Большая их часть сбрасывалась в поставленную шершням для питья открытую чашку Петри с водой. На 11-е сутки началась массовая гибель насекомых. Клиническая картина при этом очень напоминала вирусный паралич у медоносных пчел. С 12-х по 14-е сутки количество погибающих насекомых сокращалось. На 15-е сутки погибших взрослых насекомых и расплода не обнаружили. Прекратилось и начавшееся с момента гибели ос постоянное разрушение гнезда за счет обгрызания нижней части свода. При электронной микроскопии кишечника шершней не было обнаружено каких-либо вирусных образований.

Электронная микроскопия головного мозга V. crabro выявила вирусоподобные образования размером 55-65nm, а также обширные зоны и мелкие скопления меланина (рис. 5, 6). Вирусные образования морфологически отличались от вируса паралича пчел. Реакция диффузионной преципитации в агаре не выявила антигенного родства между этими вирусами.

Заражение пчел, свободных от вируса паралича, материалом, приготовленным из V. crabro в период их массовой гибели, вызвало массовую гибель пчел в условиях садковых опытов. Однако во втором и третьем пассажах пчелы не погибали.

Следует отметить, что гибель пчел обнаруживалась только при инокуляции вирусного материала в гемоцель и не отмечена при заражении методом скармливания.


Рис. 3. Кормушка в вольере B. hortorum

Рис. 4. Конвульсивное состояние у зараженной особи V. crabro.

Рис. 5. Вирусоподобные образовании в головном мозге шершня V. crabro (первичное увеличение 27•103Х).

Рис. 6. Вирусоподобные образования в головном мозге шершня V. crabro (первичное увеличение 50•103X).


Безусловно, круг заражаемых хозяев позволяет составить определенные представления о специфичности вируса. Однако при этом мы сталкиваемся со многими факторами, затрудняющими окончательное решение вопроса. К таким факторам относится, прежде всего, возможность активации собственной латентной инфекции при заражении чужеродным вирусом [3], что и произошло в данном случае. Необходимы дальнейшие исследования большого числа видов одиночных пчел для определения круга заражаемых хозяев вирусов Apis mellifera L.

Авторы весьма признательны доктору биологических наук В. В. Гулию за содействие и помощь в работе.


Литература


1. Bailey L., Gibbs A. I., Woods R. D. Sacbrood viruses of the larvae honey bee (Apis mellifera Linnaeus). Virusology, 1964, 23, p. 425-429.

2. Вaileу L. Recent research on honey bee viruses. Bee World, 1975, 56, 2, p. 55-64.

3. Тарасович Л. M. Вирусы насекомых. - М.: Наука, 1975, с. 89.

4. Талпалацкий П. Л. К этиологии летней гибели пчел в Приморском крае. - В кн.: Вирусологические исследования на Дальнем Востоке. Владивосток, 1969, с. 105-107.

5. Дунин М. С., Попова Н. Н. Капельный метод диагностики вирусов в растениеводстве. - М.: Сельхозиз, 1937.

6. Шубладзе 0. К., Гайдамович С. Я. Краткий курс практической вирусологии. - М.: Медицина, 1954.

7. Ouchterloni 0. Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. Progr. in Aller., 1958, p. 51.

8. Зильбер Л. A., Абeлeв Г. И, Вирусология и иммунология рака. - М.: Медицина, 1962.

9. Growle А. I. Enchancement by cadmium of double diffusion precipitation reactions. J. Immunol., 1958, 81(3), p. 194.

10. Growle A. I. Enchancement by varions cations of the double diffusion precipitation on test. Iut. Acch. Allergy, 1960, 16, p. 113.

11. Талпалацкий П. Л., Полтев В. И., Гулий В. В. Цитоморфология эпителия кишечника при экспериментальном вирусном параличе пчел. - Изв. СО АН СССР, 1971, вып. 3, с. 133-137.

12. Николау М. С., Кажал Н., Николау К. Элементы общей инфрамикробиологии. - Бухарест: Меридиане, 1965.

13. Гребенников В. С. Подземные приманочные ульи для шмелей. - Пчеловодство, 1972, № 7, с. 40-41.

14. Гребенников В. С. Опыт доместикации шмелей в окрестностях Исилькуля Омской области. - В кн.: Зоологические проблемы Сибири. Новосибирск: Наука, 1972, с. 67-68.

15. Гребенников В. С. К вопросам охраны шмелей - ценных опылителей. - В кн.: Охрана и реконструкция природных ресурсов в Центрально-Черноземной полосе. Изд-во Воронежского гос. ун-та, 1972, с. 76-82.

16. Гребенников В. С. Шмели - наши помощники, их надо беречь.- Корма, 1972, № 5, с. 27-28.

17. Гребенников В. С. Опыт организации энтомологических заповедников и документальное их оформление. - В кн.: Об охране насекомых: Материалы II совещания Межд. горного комитета, секция охраны насекомых.- Ереван, 1975, с. 31-41.